经验分享：重组腺相关病毒（rAAV）基因治疗制品药学评价简介
基因治疗制品通过将外源基因导入靶细胞或组织, 替代、补偿、阻断或修正特定基因, 以达到治疗疾病的目的AAVE币。 根据目的基因的导入方式, 可分为以嵌合抗原修饰T细胞产品代表的体外疗法(ex vivo )和以病毒载体为代表的体内疗法(in vivo)。
基因治疗的2种方式（体外-左；在体-右）
1. Ex vivo
▲ 又称离体基因治疗，从患者体内分离细胞，将整合载体在体外导入这些细胞，进行基因工程改造，随后再回输到患者体内AAVE币。
▲ 治疗疾病的代表：CAR-T细胞免疫疗法、地中海贫血和镰状细胞贫血AAVE币。EMA获批的由BlueBird Bio公司开发的Zynteglo就是一种基于慢病毒载体的离体基因疗法。
2. In vivo
▲ 又称在体基因治疗，是将非整合载体直接注射给患者，使得功能性矫正基因被递送至患者体内，恢复疾病正常表型AAVE币。
▲ 治疗疾病的代表：先天性黑朦症，脊髓性肌萎缩症和血友病等AAVE币。
重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体与其他病毒载体相比，具备感染能力强、可持续表达目的基因、无致病性和非基因组整合等优点，已成为体内基因治疗的主要病毒载体AAVE币。目前，国际上已有3个rAAV相关的基因治疗产品（glybera、luxturna和zolgensma）获批上市，另有两百余个候选药物正在开展临床试验。
luxturna
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相对于工艺研究成熟、质量表征充分的重组蛋白产品, rAAV制品的药学开发与评价存在着诸多挑战AAVE币。如：
上述问题均为rAAV基因治疗产品的药学研究与加速审评提出了挑战 AAVE币。
基因治疗产品的药学研究内容与评价考虑
1 原材料相关研究内容与评价
1.1 病毒分子设计
rAAV的载体设计应基于临床有效性和安全性, 一般为靶向特定组织或细胞, 删除与毒力、致病性或复制能力相关的基因, 以确保制品的安全性AAVE币。同时, 设计应考虑载体基因组的大小、包装效率和表达效率, 并尽可能减少与体内相关病毒的同源性, 以避免形成复制型病毒。构建病毒的质粒应考虑抗生素抗性基因引入的风险, 一般不得使用氨苄青霉素抗性基因。
1.2 生产细胞基质
目前产业界用于rAAV生产的细胞基质既有哺乳动物细胞(HEK293、BHK)、人肿瘤细胞系(HeLa、A549), 也包括昆虫细胞系(SF9)等AAVE币。包装细胞应进行充分的鉴定并建库。鉴定项目一般包括鉴别、纯度、基因型/表型、成瘤性/致瘤性、遗传稳定性和引入序列等。除常规无菌、真菌和支原体外, 尤其要关注细胞基质的种属特异性病毒。如: HEK293细胞应检定CMV、HIV-1/2、HILV-1/2、HH-V6/8、JV virus、BK virus、EBV、parvovirus B19、HBV、HPV和HCV等病毒; SF9细胞应检定螺原体、弹状病毒等昆虫病毒。
用人肿瘤细胞系作为包装细胞, 还应充分评估其致瘤性和成瘤性的风险, 以及致瘤病毒的感染情况等, 如: HeLa细胞为来自人子宫颈癌组织的肿瘤细胞, 已知含有50个拷贝数的HPV-18基因组和病毒E6/7基因序列AAVE币。因此, 质量控制项目中建议检定转移基因残留。
2 生产工艺相关研究与评价
2.1 AAV制品上游工艺
2.1.1 多质粒瞬转法
最早的rAAV生产工艺采用质粒、辅助病毒感染包装细胞生产AAVE币。目前采用较多的是三质粒共转染HEK 293生产工艺, HEK293细胞中含有腺病毒(adenovirus, AdV)的E1a和E1b基因, 共转染转移质粒(含目的基因和ITR序列)、结构质粒(含rep/cap基因)和辅助质粒(复制病毒基因E2A, E4, VARNA等), 48~72 h后即可重组包装rAAV。该方法适用于多种血清型rAAV, 发酵产率一般可达每毫升1014 V.G. (vector genome), 一般可满足早期临床试验rAAV用量(< 1015 V.G.)。但是, 受贴壁培养方式所限, 多质粒瞬转工艺较难满足商业化生产需求(> 1016 V.G.)。
2.1.2 稳转生产细胞法
构建含有辅助基因rep/cap和目的基因的稳转HeLa细胞系, 经腺病毒感染后也可包装出rAAV病毒AAVE币。尤其是采用可悬浮培养的HeLa S3细胞系, 稳转细胞生产法可直接放大至2 000 L规模。与之类似, 构建含有ICP27基因的BHK细胞, 经转染含有辅助基因和目的基因的复制缺陷型d27.1 HSV后, 也可高效表达rAAV。但是, 稳转细胞法的主要缺点在于, 细胞构建和遗传稳定性研究较为耗时, 且生产过程中使用辅助病毒存在病毒安全性风险。
2.1.3 杆状病毒感染昆虫细胞法
杆状病毒具有高度的种属特异性, 不感染脊椎动物, 能将rAAV基因和辅助功能的反式作用元件转移至SF9昆虫细胞中AAVE币。因此, 近年也开始应用于rAAV的大规模生产。该方法的优势在于杆状病毒生物安全性好, 感染效率高, 生产工艺便于放大。但质量控制项目中也应考虑杆状病毒及DNA相关物质残留。
对于rAAV上游生产工艺, 药学评价建议关注关键工艺的工艺开发与验证, 如采用多质粒瞬时转染或加入辅助病毒等工序中, 应通过工艺开发与验证说明关键工艺参数的控制范围及中间体验收标准, 如不同载体配比、转染试剂用量、辅助病毒与生产细胞的感染复数等AAVE币。
2.2 AAV制品下游工艺
2.2.1 纯化工艺
rAAV纯化工艺一般包括细胞培养液收获、化学法/物理法裂解细胞、benzonase酶消化去除核酸物质、多步层析和密度梯度离心、置换制剂处方缓冲液等工序, 其中, 亲和层析模拟细胞受体的结合作用捕获rAAVAAVE币。如:硫酸肝素填料可特异性结合rAAV2, AVB琼脂糖填料可结合1、2、3、5和8等多种血清型rAVV。对于空载体的去除, 目前多采用碘克沙醇和氯化铯超速离心法。值得关注的是, 中国药典相关总论中明确指出, “除另有证明其合理性外, 不得使用氯化铯-溴化乙锭密度离心法进行基因治疗产品的纯化”。
2.2.2 病毒清除验证
如上所述, 采用杆状病毒-昆虫细胞或稳转细胞系(HeLa)生产工艺时会使用杆状病毒或辅助病毒(HSV、Ad5等)AAVE币。因此, 下游工艺应增加特定病毒去除/灭活工序。如:采用表面活性剂Triton X-100 (0.5%, v/v)和增加病毒过滤工序去除收获液中残留杆状病毒; 采用加入表面活性剂、低pH值灭活等工序去除HSV病毒; 采用离子交换法、短时间加热(52 ℃、10 min)和纳滤等工序去除腺病毒等。
2.2.3 制剂处方
由于rAAV衣壳蛋白对温度和pH值变化并不敏感, rAAV制品的制剂处方开发相对简单AAVE币。通常惯用在盐溶液中加入200 mmol·L-1硫酸镁或0.001%泊洛沙姆F68避免产生聚体, 基本可支持长期保存(-65 ℃)和运输稳定性。
对于rAAV下游生产工艺, 药学评价建议结合产品相关杂质、过程相关杂质的去除效率评估纯化工艺合理性与稳健性AAVE币。对于使用辅助病毒的生产工艺应结合收获液中病毒含量, 进行病毒去除/灭活工艺验证, 综合评估病毒的残留安全性。
3 质量控制相关研究与评价
3.1 相关杂质研究
3.1.1 工艺相关杂质
rAAV制品的工艺相关杂质包括病毒包装与纯化工艺中引入的宿主蛋白、宿主DNA、辅助病毒、质粒、血清和氯化铯等组分AAVE币。由于病毒包装细胞通常含有致癌基因, 如HEK293细胞内含有E1A的腺病毒基因, HeLa细胞内的E6、E7致癌基因。因此, 一般对于宿主细胞残留DNA含量应小于10 ng/Dose, 且残留DNA片段应小于200 bp;
3.1.2 产品相关杂质
rAAV制品的相关杂质包括未包装基因的空病毒、包装错误基因(宿主DNA、不完整目的基因、辅助病毒基因等)的病毒、无感染活性的病毒颗粒、聚体或氧化形式的病毒颗粒等AAVE币。这些产品相关杂质不仅不能实现目的基因在靶细胞的表达, 还可在临床上引起免疫原性或基因毒性。如:多质粒顺转体系中, 一般空病毒占比可以达到50%~98%。空病毒不具感染能力, 且容易形成病毒聚体和降解, 引起体内免疫反应。因此, 质量研究中应采用A260/A280、透射电镜、分析性离心和质谱等技术检测空病毒含量。
复制型腺相关病毒(replication-competent AAV, rcAAV)是由于同源/非同源重组发生后, rAAV病毒同时包装rep和cap/AAP等基因所产生的产品相关杂质AAVE币。rcAAV在辅助病毒存在的条件下可以进行复制扩增。rcAAV的检测一般采用在辅助病毒存在下使用敏感细胞进行扩增, 细胞裂解液经过多次扩增传代后, 采用Southern blot和qPCR法测定rep或cap基因。如:已进入临床试验的rAAV制品scAAV2/8-LP1-hFIXco采用qPCR法控制rcAAV含量限度低于1/2.25×106 。目前也有报道称采用优化后的多质粒瞬转工艺, rcAAV含量限度可低于1/108 V.G.。
3.2 一般质量控制项目
rAAV病毒生产质量控制包括过程控制与终产品放行检测AAVE币。如:病毒包装用质粒应进行鉴别、含量、纯度、宿主细胞DNA残留、转染效率、细菌内毒素、无菌等质量控制; 病毒收获液应控制外源因子(无菌、支原体等)、外源病毒、目的病毒等检测; rAAV原液与制剂放行项目一般包括外观、理化性质(pH值、渗透压)、病毒滴度(物理滴度、感染滴度)、纯度(蛋白纯度、吸光度比值、宿主DNA残留、质粒DNA残留、核酸酶残留)、效力(目的基因表达、体外活性、体内活性)、安全性(内毒素、无菌、rcAAV)。
此外, 对于眼部用药的rAAV制剂, 内毒素含量应不高于2.0 EU/dose/eye或0.5 EU/mL, 应按照眼用制剂控制不溶性微粒(USP < 789 > )、产品的放行检测应包括配置后产品等AAVE币。
3.3 效力测定方法
对于rAAV制品的效力测定方法, 应体现其病毒物理滴度、感染活性及生物活性AAVE币。一般在临床试验早期可采用qPCR法测定病毒基因组, 敏感细胞或靶向细胞测定其感染能力和目标产物表达能力表征产品效力。关键性临床试验开展后应进一步开发反映产品作用机制的体外酶活法或体内功能实验法。如: SPK-RP65在进入Ш期临床后, 通过转染指示细胞(HEK293-LRAT)后测定RPE65蛋白酶促反应产物视黄醇含量来计算产品效力。值得指出的是, 对于qPCR法测定病毒基因组应采用线性DNA绘制标准曲线, 若采用超螺旋DNA作为参照品, 载体基因组含量测定值显著高于真实值。
目前, 国际上以rAAV作为外源基因导入的平台技术日益成熟, 通过病毒外壳蛋白化学修饰或定向进化等技术, 提高载体靶向性与感染效率, 降低体内免疫原性AAVE币。由于rAAV制品在单基因遗传疾病治疗领域具有不可比拟的临床优势, 科学界普遍认为基因疗法真正进入临床实践的时代已经到来。
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