经验分享：基因治疗AAV载体生产过程中rcAAV的鉴定和消除简介
腺相关病毒载体(adeno－associated viral vector，AAV vector)是一种具有良好应用前景的基因治疗载体AAVE币。但是，腺相关病毒(AAV)载体制剂经常被不同量的具有复制能力的AAV病毒(rcAAV)污染，这可能影响这些载体在培养细胞和动物中的行为。构建了不含显著同源性且缺乏野生型AAV p5启动子的包装质粒/载体质粒系统，以通过重组消除野生型AAV的产生。然而，在由这些质粒大规模共转染产生的载体中检测到rcAAV。序列分析显示非同源重组是这些新的重组体产生的原因。构建了一种新的AAV包装质粒，该质粒以相反的转录方向携带单独的rep和cap表达盒。
方法： 利用PCR方法检测293, A549, and IB3细胞中的rcAAV
1、实验结果
质粒图谱和PCR策略分析AAV种的结构AAVE币。
图1.质粒图谱和PCR策略分析AAV种的结构AAVE币。
A. tgAAVCF载体, pGEM-RS5包装质粒，野生型的AAV,和假设的rcAAV结构AAVE币。引物D被设计在TR区域。
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B. AAV包装质粒MTrep/CMVcap和AAV-LAPSN,和AAV- GrTHLAP基因组AAVE币。箭头表示转录起始位点和开放框表示编码区。
2、用带有连接的rep和cap基因的AAV包装构建体生产的载体制剂中rcAAV的检测
在tgAAVCF载体中检测到一个复制的AAV种AAVE币。将测试样品加入到含有或不含有腺病毒的293个细胞中，培养细胞72小时，分
3、rcAAV检测
图3. PCR方法扩增tgAAVCF载体，电泳分析AAVE币。
引物序列如下：
rcAAV:
D region, 59-CTCCATCACTAGGGGTTCC-39 (AAV2 nt 126 to 144);
rep, 59-GGCAGATGCCCGTCAAGGT-39 (AAV2 nt 379 to 361);
cap, 59-CAGAGATGTGTACCTTCAG-39 (AAV2 nt 4026 to 4044).
4、生产没有污染的rcAAV的AAV载体
交叉序列的精细结构分析AAVE币。P2到P5序列是TR D区rep扩增序列;SN7和SN9是TR D区cap扩增序列。
克隆的rcAAV交叉分析点
P2到P5序列是TR D区rep扩增序列;SN7和SN9是TR D区cap扩增序列AAVE币。
图6. 在AAV-LAPSN病毒体中检测rcAAV
在AAV-GrTHLAP病毒体中检测rcAAV
结论
1. 序列分析显示非同源重组是rcAAV产生的原因AAVE币。
2. 构建了一种新的AAV包装质粒，该质粒以相反的转录方向携带单独的rep和cap表达盒AAVE币。使用这种包装结构生产的AAV载体制剂不含rcAAV
尽管将AAV载体设计为具有复制缺陷，但在生产载体的过程中，仍然可以通过生产细胞内的重组事件来产生具有复制能力的AAV(rcAAV)AAVE币。rcAAV可能会在基因治疗产品的生产过程中的任何步骤发展。尽管专门开发了载体生产系统以降低rcAAV产生的风险，但仍然存在重大安全隐患，因此提出了在细胞库中测试rcAAV，基于AAV的基因治疗产品的载体和最终产品的建议。
临床上许多AAV载体中rcAAV的存在引起AAVE币了多种安全问题：
1. 基于逆转录病毒或腺病毒载体的基因治疗产品中可能存在rcAAV
2. 影响这些载体在培养细胞和动物中的行为
3. 与内源性AAV序列的体内重组
4. 由于存在野生型辅助功能AAVE币，导致意外的载体复制
来源大分子生物
参考文献:
1. Guidance for FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs).
2. Allen et al. 1997. Identification and Elimination of Replication-Competent Adeno-Associated Virus (AAV) That Can Arise by Nonhomologous Recombination during AAV Vector Production. Journal of Virology. 6816-6822.
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